Christian Schmelzer

Massenspektrometrische Charakterisierung von Proteinhydrolysaten: Verdaustudien an β-Casein und Strukturuntersuchungen an Elastin

Kumulative Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 04.05.2007

Abstract
In der vorliegenden kumulativen Dissertation wurden zwei Fragestellungen der Proteinanalytik unter Einsatz moderner komplementärer massenspektrometrischer Verfahren bearbeitet.
Der erste Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Entstehung von bioaktiven Peptiden beim Verdau von Nahrungsproteinen. Dazu wurde das Milchprotein β-Casein unter gastroanalogen Bedingungen hydrolysiert und die Spaltprodukte mittels Elektrospray- und MALDI-Massenspektrometrie untersucht. Durch die Identifikation von 138 Peptiden, mit denen eine vollständige Sequenzabdeckung erzielt werden konnte, ließen sich Aussagen zum zeitlichen Verlauf der Hydrolyse, zu den Spaltstellen der Protease Pepsin sowie zum Verbleib von bioaktiven Bereichen des β-Caseins treffen. Der Nachweis eines Aminosäureaustauschs in Position 93 belegt zudem die Existenz einer weiteren genetischen Variante des β-Caseins auf Proteinebene.
Der zweite Teil der Arbeit widmet sich der Untersuchung der Primärstruktur des unlöslichen Faserproteins Elastin, das gemeinsam mit anderen Strukturproteinen Bestandteil der extrazellulären Matrix ist und Geweben vieler Organe Elastizität verleiht. Es konnte gezeigt werden, dass aus der Haut isoliertes Elastin mit verschiedenen Proteasen breiter Spezifität effektiv gespalten werden kann. Die verwendeten Enzyme Elastase, Pepsin und Thermitase spalteten dabei überwiegend C-terminal von vier der fünf häufigsten Aminosäuren des Elastins. Insgesamt wurden 254 Peptidsequenzen ermittelt, mit denen eine auf das Vorläuferprotein Tropoelastin bezogene Sequenzabdeckung von 74 % erreicht und Aussagen zur alternativen Spleißvariante Hautelastins getroffen werden konnten. Erstmalig konnte zudem eine partielle Prolinhydroxylierung in 33 Positionen humanen Hautelastins nachgewiesen werden.

The thesis deals with two objectives of protein analytics employing modern complementary mass spectrometric techniques.
Subject of the first part is the release of bioactive peptides during the digestion of food proteins. Hence, the milk protein β-casein was hydrolysed under gastric conditions and its degradation products were characterised by means of electrospray or MALDI mass spectrometry. 138 different peptides were identified and with these a complete sequence coverage was obtained. The results provide insights into the time course of the digestion, the preferred cleavage sites of the protease pepsin, and the fate of bioactive β-casein peptides. Moreover, an amino acid variation observed in position 93 proves the existence of an additional genetic variant of bovine β-casein which has not yet been defined.
The second part addresses the investigation of the primary structure of elastin, an insoluble fibre protein. Elastin like other structure proteins is a component of the extracellular matrix and provides elasticity to the tissue of many organs. It was demonstrated that elastin isolated from human skin can be effectively digested by different proteases of broad specificity. The used enzymes elastase, thermitase, and pepsin predominantly cleaved C-terminal to four of the five major amino acids of elastin. Overall, 254 peptide sequences were determined resulting in a sequence coverage of 74 % with respect to the precursor tropoelastin. The results facilitate conclusions about the alternative splice variant of human skin elastin on the protein level. For the first time, the extent and location of proline hydroxylation in human skin elastin were determined.

Keywords:
bioaktive Peptide, Casein, Elastin, Haut, Massenspektrometrie, Prolinhydroxylierung, Elektrospray, MALDI

bioactive peptides, casein, elastin, mass Spectrometry, skin, proline hydroxylation, electrospray, MALDI

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungs- und Symbolverzeichnis (i-viii)
1 Einleitung (1-3)
2 Grundlagen der Massenspektrometrie in der Peptid- und Proteinanalytik (4-15)
3 Verdaustudien an β-Casein (16-29)
4 Strukturuntersuchungen an Elastin (30-47)
5 Zusammenfassung (48-50)
6 Literatur (51-63)
Publikationsliste
Anhang: Der Dissertationsschrift zu Grunde liegende Veröffentlichungen