Christiane Rothkegel

Molekularbiologische und pharmakologische Untersuchungen zur Aktivierung der löslichen Guanylatcyclase

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 05.07.2007

Abstract
Die lösliche Guanylatcyclase (sGC), ein obligates Heterodimer aus einer alpha- und einer Häm-bindenden beta-Untereinheit, ist der endogen ubiquitär expremierte Rezeptor für Stickstoffmonoxid (NO). Bindung von NO an die prosthetische Hämgruppe aktiviert die sGC und führt durch eine gesteigerte Bildung des "second messenger" cGMP über verschiedene Effektorsysteme letztendlich zu einer Gefäßerweiterung. Erkrankungen des kardiovaskulären Systems (z.B. systemischer und pulmonaler Hochdruck, Herzinsuffizienz, Atherosklerose) gehen einher mit einer Beeinträchtigung des NO/sGC/cGMP-Signalwegs. Die Pathogenese dieser Erkrankungen ist assoziiert mit einer verminderten Bioverfügbarkeit sowie einem reduzierten Ansprechen auf endogen produziertes NO. Durch die Entwicklung Häm-abhängiger sGC-Stimulatoren, wie BAY 41-2272, und Häm-unabhängiger sGC-Aktivatoren, wie BAY 58-2667, wurden erstmals Wirkstoffklassen identifiziert, die die sGC NO-unabhängig aktivieren.
In der hier vorliegenden Arbeit sollten die strukturellen Grundlagen der Aktivierung und Regulation der sGC untersucht werden. Mittels Mutagenesestudien konnte gezeigt werden, dass Serin137 der beta-Untereinheit gemeinsam mit den Ankeraminosäuren der Hämgruppe das charakteristische sGC-Hämbindungsmotiv Tyrosin135-x-Serin137-x-Arginin139 formt. Ebenfalls wurde erstmalig eine Beteiligung der Aminosäuren Aspartat44, Aspartat45 und Phenylalanin74 der beta-Untereinheit an der Häm-vermittelten Aktivierung der sGC nachgewiesen. Weitere Untersuchungen zeigten, dass die Bevorzugung der Bindung von NO gegenüber einer Bindung von Sauerstoff an die Hämgruppe der sGC nicht allein - wie in der Literatur postuliert - durch das Fehlen eines polaren Tyrosins in der Hämbindungstasche erklärbar ist. In einer bimolekularen Fluoreszenz Komplementationsanalyse konnte erstmals in einer intrazellulären Umgebung eine Beteiligung der Aminosäuresequenzen 363-373, 403-422, 440-459 der alpha-, sowie 212-222, 304-333, 344-363 und 381-400 der beta-Untereinheit an der sGC-Heterodimerisierung gezeigt werden. Demnach ist die Dimerisierungsregion der sGC diskontinuierlich aufgebaut und bildet zum Teil eine amphipathische alpha-Helix Struktur aus. Hinsichtlich der Aktivierbarkeit der sGC wurde an isolierten Gefäßen nachgewiesen, dass die relaxierende Wirkung des NO- und Häm-unabhängigen sGC-Aktivators BAY 58-2667 bei Vorbehandlung der Gefäße mit dem sGC-Oxidans ODQ verstärkt ist. Weitergehende Untersuchungen des sGC-Aktivators BAY 58-2667 an isolierten Gefäßen von verschiedenen Tiermodellen, die mit endothelialer Dysfunktion assoziiert sind, sowie an isolierten Gefäßen von Typ-II-Diabetikern zeigten eine stärkere Wirkung von BAY 58-2667 an erkrankten Gefäßen. Dies ist ein Hinweis dafür, dass unter Einfluss von oxidativem Stress der Anteil der oxidierten/hämfreien Form der sGC an der Gesamtmenge der sGC ansteigt.

Soluble guanylate cyclase (sGC), an obligate heterodimer consisting of an alpha- and a heme-containing beta-subunit, is the ubiquitous intracellular receptor for the biological messenger nitric oxide (NO). Activation of sGC upon binding of NO to its heme moiety results in an increased generation of the second messenger cGMP which modulates via various effector systems many physiological processes including vasodilatation, neurotransmission and platelet aggregation. Several cardiovascular diseases (e.g. pulmonar and systemic hypertension, heart failure and atherosclerosis) have been linked to an impaired NO/sGC/cGMP-pathway. The pathogenesis of these diseases has been associated with a reduced bioavailability of NO and a reduced activation of sGC by endogenous NO. With heme-dependent sGC-stimulators, like BAY 41-2272, and heme-independent sGC-activators, as BAY 58-2667, two substance classes have been identified that activate the sGC NO-independently.
In the present work the structural basis for the activation and regulation of sGC was investigated. A mutagenic study revealed that serin137 of the beta-subunit forms together with the heme anchoring residues the unique sGC-heme binding motif tyrosine135-x-serin137-x-arginine139. Moreover, aspartat44, aspartat45 and phenylalanin74 of the beta-subunit were identified as being crucially important for the heme-dependent sGC activation. The analysis showed that the selectivity of sGC to bind NO instead of oxygen to its heme moiety is not only - like postulated in the literature - due to the absence of a polar tyrosine within the heme pocket. Using the newly developed method of bimolecular fluorescence complementation we were able to demonstrate for the first time in an intracellular environment that amino acids 363-373, 403-422, 440-459 of the alpha-, and 212-222, 304-333, 344-363, 381-400 of the beta-subunit mediate sGC-subunit heterodimerization. This indicates that the dimerization interface of sGC has a discontinuous make-up and contains in part an amphipathic alpha-helix. Concerning sGC-activation we were able to show that pretreatment of isolated vessel with the sGC-oxidant ODQ led to an enhanced relaxation of these vessels by BAY 58-2667. Furthermore it could be shown that the BAY 58-2667 induced relaxation is potentiated in isolated vessels from animal models which are associated with increased oxidative stress as well as in vessels from type-II-diabetes patients. This suggests that under conditions of oxidative stress the redox equilibrium of sGC is shifted towards the oxidized/heme-free form.

Keywords:
lösliche Guanylatcyclase, sGC, Stickstoffmonoxid, NO, BAY 41-2272, BAY 58-2667, cGMP, Bimolekulare Fluoreszenz Komplementation, BiFC, Dimerisierung

soluble guanylate cyclase, sGC, nitric oxide, NO, BAY 41-2272, BAY 58-2667, cGMP, bimolecular fluorescence complementation, BiFC, dimerization

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungen (1-7)
1 Einleitung (8-23)
2. Material und Methoden (24-50)
3. Ergebnisse (51-78)
4. Diskussion (79-97)
5. Zusammenfassung (98-100)
6. Literatur (101-109)
7. Eigene Publikationen (110)
Anhang (111)