Kerstin Reinhardt

Subtraktive In-vitro-Immunisierungsstrategien zur Generierung tumorspezifischer T-Zellen

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Medizin (Dr. med.) vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 16.01.2008

Abstract
In der vorliegenden Arbeit wurde anhand von in vitro Experimenten der allogene T-Zell-Transfer als immuntherapeutischer Ansatz zur Behandlung von Tumoren näher untersucht. Dafür wurde zunächst das Bindungsvermögen von 7 verschiedenen tumor- und gewebespezifischen Peptiden an HLA-A2 positive T2-Zellen in FACS-Analysen überprüft und mit zwei Vorhersage-Algorithmen (SYFPEITHI- und Bimas-Score) verglichen. Dabei zeigte sich, dass das gemessene Bindungsvermögen der Peptide an T2-Zellen sehr gut mit dem SEIFPEITHI-Score und geringer mit dem Bimas-Score korrelierte. Eine Stimulationskinetik der allogenen T-Zellen aktiviert mit den verschieden gepulsten T2-Zellen wurde aufgenommen und wies dabei weder eine Peptid- noch eine HLA-Haplotyp-Spezifität auf. Das Stimulationsmaximum war nach 5 bis 6 Tagen erreicht. Zur Selektion peptidspezifischer T-Zellen wurden 2 Depletionsverfahren (IFN-γ-Sekretionsanalyse und AICD-Depletion) überprüft. Im Vergleich dieser zeigte es sich, dass ein größerer Depletionseffekt durch AICD-Depletion erzielt wurde. Um die Funktionalität der depletierten T-Zellen zu überprüfen wurde ein Granzym B-ELISpot angewandt. Darin konnte eine Peptidspezifität nicht nachgewiesen werden, was vor dem Hintergrund der ausgeprägten Alloreaktivität bei Verwendung allogener T-Zellen auch äußerst problematisch ist. Von den in dieser Arbeit verwendeten Peptiden konnten für das tumorspezifische Peptid 6 (aus EWS/FLI-1) und das gewebespezifische Peptid 2 (aus CD79B) Hinweise für eine peptidspezifische Aktivierung gewonnen werden.

In the following study we used in vitro experiments to analyse the allogenic T-cell-transfer as an immunotherapeutic approach to tumor treatment. Using FACS-analysis we tested the binding ability of seven different tumor and tissue specific peptides to HLA-A2 positive T2 cells. The results were compared against two prognosis algorithms (SYFPEITHI- and Bimas-Score). The comparison showed that the measured peptide binding ability to T2-cells correlated strongly with the SYFPEITHI-Score and less with the Bimas-Score. We recorded a stimulation kinetic of allogenic T-cells activated with different pulsed T2-cells, which showed neither a peptide specificity nor a HLA- haplotype specificity. The maximum of stimulation was reached after five to six days. Two depletion methods (IFN-γ-Secretion-Assay and AICDDepletion) were tested for the selection of peptide specific T-cells. By comparison, the higher depletion effect was reached through AICD-Depletion. The granzyme B-ELISpot was applied to test the functionality of depleted T-cells. However, a peptide specificity could not be detected. This could also be extremely problematic because of the distinctive alloreactivity in using allogenic T-cells. In summary, of the seven peptides analysed, we found evidence of peptide specific activation for the tumor specific peptide 6 (EWS/FLI-1) and the tissue specific peptide 2 (CD79B).

Keywords:
Allogener T-Zell-Transfer, Depletion, Tumorantigen, AICD, Alloreaktivität, Peptidspezifität, T2-Zelle

Allogenic T-cell-transfer, depletion, tumor antigen, AICD, alloreactivity, peptide specificity, T2-cell

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Referat, Inhaltsverzeichnis, Abbildungsverzeichnis, Tabellenverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung (1-24)
2 Zielsetzung (25-26)
3 Material und Methoden (27-35)
4 Ergebnisse (36-59)
5 Diskussion (60-67)
6 Zusammenfassung und Ausblick (68-69)
7 Literaturverzeichnis (70-77)
8 Thesen (78-79)