Tanja Pelz

Respiratorische Mitochondrienfunktion in implantierten R1H-Rhabdomyosarkomen im Vergleich zu normalen Skelettmuskeln der Ratte

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Medizin (Dr. med.) vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 25.02.2008

Abstract
Einleitung: Veränderungen der respiratorischen Mitochondrienfunktion prägen den Energiemetabolismus in Tumoren. Respirometrische Untersuchungen mitochondrialer Parameter an normalen und pathologisch veränderten Geweben werden schon seit einiger Zeit durchgeführt. Um spezifische Veränderungen der mitochondrialen Atmung in Tumorgeweben detektieren zu können, müssen immer Vergleiche mit den gesunden Ausgangsgeweben erfolgen.
Material und Methoden: Es wurden neurologisch etablierte Untersuchungsmethoden an Tumorzellen und -geweben durchgeführt, wie die hochauflösende Respirometrie und die Enzymdiagnostik. Untersucht wurden 11 Skelettmuskeln von Ratten, die als Normalgewebe mit pathologisch verändertem Tumorgewebe verglichen wurden. Als pathologisch verändertes Gewebe diente ein implantierter Experimentaltumor das R1H-Rhabdomyosarkom. Die Permeabilisation der Zellmembranen erfolgte bei beiden Gewebearten mittels der skinned fiber- Technik. Die respirometrischen Messungen wurden mittels der multiplen Substrat- Inhibitor- Technik durchgeführt. Die OXPHOS- Kapazitäten wurden respirometrisch sowie photospektrometrisch- enzymatisch bestimmt und zusätzlich wurden die zytosolischen glykolytischen Markerenzyme gemessen.
Ergebnisse: Zunächst wurden an 11 Ratten respirometrisch die Atmungsraten der R1H-Rhabdomyosarkome am Oxygraphen bestimmt. Die Atmungsaktivität am Komplex I war im R1H-Tumor gegenüber dem Skelettmuskel deutlich verringert (0,56 ± 0,28 nmolO2/mg/min vs. 2,32 ± 1,19 nmolO2/mg/min, p<0,0001). Ebenfalls verringert waren die Atmungsaktivität am Komplex II (1,00 ± 0,29 nmolO2/mg/min vs. 1,55 ± 0,63 nmolO2/mg/min, p<0,001) sowie die SRPR ist im Tumor (56 ± 25% vs. 145 ± 56 %, p<0,001). Dies wurde durch eine erhöhte Rotenon- insensitive NADH-Oxidation in Bezug zur Gesamtaktivität des Komplex I gestützt (R1H-Rhabdomyosarkom 15 ± 8% vs. Rattenmuskel 80 ± 7%, p<0,001).
Diese Ergebnisse wurden mit der Photospektrometrie überprüft. Es zeigte sich eine besondere Aktivitätsabnahme der CS im R1H gegenüber dem Muskel (7,1 ± 2,4 U/g vs. 15 ± 2,8 U/g Trockengewicht, p<0,001). Des Weiteren wurde ein Anstieg des Verhältnisses COX/ CS in den R1H-Tumoren gesehen (71 ± 30 vs. 60 ± 17, n. s.). Das Verhältnis der Enzymaktivitäten der Komplexe II+III/CS nahm leicht im R1H zu (31 ± 19 vs. 23 ± 7, n. s.). Dagegen kam es zur Abnahme der Enzymaktivitäten der R1H, wenn man die Verhältnisse der Komplexe I+III/CS (3 ± 4 vs. 4 ± 2, n. s.) und I/CS (6 ± 3 gegen 12 ± 4, p< 0,018) bildet. Bestimmt man die SRNO, so ergab sich eine messbare Abnahme im R1H-Tumor (13 ± 11 % vs. 22 ± 13%, n.s.). Weiterhin wurden die Mittelwerte und Standardabweichungen der Atmungsraten von 9 Proben aus dem Tumorrand und 9 Proben aus dem Tumorzentrum aus 2 Tumoren verglichen. Die mittlere Atmungsaktivität im Komplex I war im Randbereich gegenüber dem Tumorzentrum leicht verringert (16,8 ± 6,7 J-O2/mg/min vs. 20,2 ± 3,1 JO2/mg/min). Ebenfalls verringert war die Atmungsaktivität im Komplex II im Randbereich (19,2 ± 5,2 J-O2/mg/min vs. 20,7 ± 2,9 J-O2/mg/min) und die SRPR (88,2 ± 15% gegen 97 ± 11 % gegen 93 ± 9%). Die Ergebnisse zeigten somit eine diskret verringerte Atmungsrate der Komplexe I und II im Randbereich gegenüber dem nekrotischen Tumorzentrum.
Schlussfolgerungen: Die angewandten Techniken ermöglichen es, reproduzierbar und verifizierbar die Funktionen der OXPHOS in Tumoren und auch in gesunden Geweben zu prüfen. Zudem konnten spezifische respirometrische Defekte in den Tumormitochondrien bewiesen werden.

Introduction: Indisputably, mitochondria play an important role in the energy metabolism of tumor cells.
Objective: The aim of the study was to determinate mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) functions in rat rhabdomyosarcoma R1H (R1H) and rat skeletal muscles.
Material and Methods: Biopsies of the implanted rat rhabdomyosarcoma R1H, growing subcutaneous in the right flank of 11 female WAG/RijH- rats (200 + 210g), were investigated. For that purpose skinned fiber technique, high resolution respirometry and multiple substrate inhibitor titration were adapted to tumor samples. Enzyme activities were determined at 30C, using a DU 640 photometer (Beckmann Instruments, Palo Alto, CA, USA). Double determinations were carried through with two different weights of the samples. Enzyme activities were referred to the noncollagen protein and to the activity of the mitochondrial marker enzyme citrate synthase (CS), measured in the same sample. Data were calculated by the Mann-Whitney test (U-test) and the commercial available program SPSS for windows 11.0. All values were expressed as mean values ± S.E.M. Differences were significant, if P < 0.05.
Results: In our animal tumor model (R1H) functional abnormalities of OXPHOS were found compared to skeletal muscles. The respiratory rates demonstrate that the pyruvate respiration in tumors decrease, whereas the succinate respiration even increase. Typical respirograms shows a substantial decrease of succinate-related pyruvate respiration (SRPR) in tumor mitochondria compared to mitochondria of skeletal muscles: 56 ± 25% versus 145 ± 56%, P = 0.001. In comparison to skeletal muscles in tumors the specific state 3 respiration of pyruvate + malate was decreased: 0.56 ± 0.28 nmol O2/mg/min versus 2.32 ± 1.19 nmol O2/mg/min, P < 0.001, and the specific state 3 respiration of succinate + rotenone was increased: 140 ± 59 nmol O2/mg/min versus 103 ± 38 nmol O2/mg/min, n.s. The rotenone-insensitive respiration in tumors reached higher levels than the antimycin A-insensitive respiration, whereas in normal muscles the converse was observed. This indicates that in rhabdomyosarcoma R1H the complex I has a decreased rotenone sensitivity. Interestingly, in R1H we observed an obviously increased rotenone-insensitive respiration compared to the antimycin A-independent respiration. In addition, the CAT-insensitive respiration related to the succinate-dependent respiration was increased in R1H, considerably. Additionally, the notable difference between the CAT- and the antimycin A-independent respiration indicates an increased part of leak respiration in R1H tumor mitochondria. In R1H the CS was 7.1 ± 2.4 U/g tissue versus 15.0 ± 2.8 U/g tissue in skeletal muscles. That means that in R1H the total amount of mitochondria was reduced over 53%. The results of the respirometric measurements were in line with the increase of the enzymatic activity of complex II + III and the significant decrease of the enzymatic activity of complex I, both related to the CS-activity. The complex I was in R1H 6.0 ± 3.0% of CS versus 12.0 ± 4.0% of CS in rSM; P = 0.018. This was a reduction over 50%. In contrast, in R1H the complex II + III was 31 ± 19% of CS versus 23 ± 7% of CS in rSM; n.s.. The specific reduction of the complex I-dependent function is also detectable by the decrease of succinate-related NADH-oxidation (SRNO): 13 ± 11% in R1H versus 22 ± 13% in rSM (- 41%).
Conclusion: In conclusion, by the use of the skinned fiber technique and the multiple substrate inhibitor titration several alterations of tumor mitochondria can be measured in one series of tests. By now, the high feasibility of these techniques is appreciated for the investigation of muscles and prospectively for tumors, too. In tumor cells of our animal model (R1H) functional abnormalities of the respiratory chain complexes were found, in contrast to muscle cells. In R1H a decrease of complex I-activity and a varied ratio of pyruvate-dependent succinate respiration in favor of succinate respiration were verified. That might be a common phenomenon of malign tumors, but not a specific one.

Keywords:
Endogene Atmung, hochauflösende Respirometrie, skinned-fiber Technik, multiple Substrat-Inhibitor-Technik, R1H- Rhabdomyosarkom, Skelettmuskel, Komplex-I-Defekt, Glykolyse

Endogenic respiration, high-resolution respirometry, skinned-fiber technique, multiple substratxe inhibitor technique, R1H- rhabdomyosarcoma, skeletal muscle, complex-I deficiency, glycolysis

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Referat, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung (1-7)
2 Material und Methoden (7-23)
3 Ergebnisse (23-34)
4 Diskussion (34-47)
5 Zusammenfassung und Schlussfolgerung (47-48)
6 Literatur (48-62)
7 Thesen (63-65)
Publikationen