Christian Marx

Optimierung einer mikrobiellen Transglutaminase mittels Random Mutagenese

Kumulative Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 05.09.2008

Abstract
Die mikrobielle Transglutaminase (MTG) ist ein Enzym aus der Klasse der Transferasen, das in der Lage ist, Proteine kovalent zu verknüpfen. Sie findet hauptsächlich in der Lebensmittelindustrie Anwendung, wird aber auch für eine Immobilisierung von Enzymen eingesetzt, sowie bei der Produktion abbaubarer Polymere aus nachwachsenden Rohstoffen. Die MTG wird bisher durch Fermentation des Originalstamms Streptomyces mobaraensis gewonnen, sämtliche Versuche einer löslichen Expression in E. coli schlugen bislang fehl. Eine lösliche Expression ist jedoch Voraussetzung, um das Enzym mittels Random Mutagenese verändern zu können. Ein Ziel für solche Veränderungen ist beispielsweise eine erhöhte Thermostabilität für den Einsatz in Prozessen mit höherer Temperatur. Eine hitzeempflindliche Variante ist dagegen interessant für Anwendungen, bei denen das Enzym nach der Reaktion in kurzer Zeit thermisch inaktiviert werden soll. Die vorliegende Arbeit beinhaltet folgende Schwerpunkte:
1. Die Pro-Form der MTG wurde in E. coli exprimiert. Ein His-Tag wurde für eine einfache Reinigung angebracht. Durch die Absenkung der Induktionstemperatur konnte erstmals eine nahezu vollständige Löslichkeit erreicht werden.
2. Es wurden kommerzielle Proteasen auf ihre Fähigkeit hin untersucht, die Pro-MTG zu aktivieren.
3. Mittels Random Mutagenese wurde erstmals eine Bibliothek veränderter MTG-Varianten erzeugt. In einem Screeningverfahren, das erstmals die Aktivierung eines Pro-Enzyms enthielt, wurden etwa 5500 Varianten untersucht. Es konnten sowohl thermostabile als auch hitzeempfindliche Varianten identifiziert werden, sowie die Regionen in der 3Dstruktur der MTG, die für die Thermostabilität des Enzyms entscheidend sind.

The microbial transglutaminase (MTG) belongs to the enzyme class of transferases. It covalently crosslinks proteins. Besides it widespread use in the food industry it has been employed for enzyme immobilization and in the production of degradable polymers from renewable resources. Until today, MTG is produced by fermentation of the original strain Streptomyces mobaraensis. All previous attempts to express the enzyme in soluble form in E. coli failed. However, a soluble expression is required to enable the optimization by random mutagenesis. An increased thermostability would be of interest for an application in processes using elevated temperatures. Heat sensitive variants could be used when the enzyme has to be thermally inactivated in a short time following the reaction. This thesis includes the following main topics:
1. The MTG was expressed in its pro-form in E. coli. A His-tag was added for easy purification. By decreasing the induction temperature, an almost completely soluble expression was achieved for the first time.
2. Commercially available proteases were examined for their ability to activate the pro-MTG.
3. Using random mutagenesis, a library of mutated MTG variants was produced for the first time. About 5500 variants were examined in a screening assay that contained the activation of a pro-enzyme for the first time. Thermostable and heat sensitive variants could be identified as well as regions within the 3D structure of the MTG that have a high impact on thermostability.

Keywords:
mikrobielle Transglutaminase, Streptomyces mobaraensis, lösliche rekombinante Expression, pro-MTG-His6, Reinigung, proteolytische Aktivierung, Charakterisierung, Random Mutagenese, Hochdurchsatz-Screening, Thermostabilität

microbial transglutaminase, Streptomyces mobaraensis, soluble recombinant expression, pro-MTG-His6, purification, proteolytic activation, characterization, random mutagenesis, high throughput screening, thermostability

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungen (1-5)
1 Einleitung und Zielsetzung (6-15)
2 Lösliche Expression rekombinanter MTG (16-23)
3 Aktivierung der rekombinanten MTG (24-33)
4 Optimierung der rekombinanten MTG (34-52)
5 Zusammenfassung (53-54)
6 Literatur (55-59)
Publikationsliste
Anhang: Der Dissertationsschrift zu Grunde liegenden Veröffentlichungen