Stephan Schürger

Untersuchungen zur Regulation der Hämoxygenase-1 durch cAMP-abhängige Prostaglandine

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 03.07.2008

Abstract
In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der Enzyme Hämoxygenase-1 (HO-1) und Ferritin als Vermittler von endothelprotektiven und antioxidativen Effekten von Prostaglandinen untersucht. Die Prostaglandinderivate PGE1, Iloprost und d-PGJ2 induzieren im Gegensatz zu PGF die HO-1 auf Proteinebene in Endothelzellen und Makrophagen konzentrations- und zeitabhängig. Darüber hinaus führte PGE1 zu einer konzentrationsabhängigen Steigerung der Ferritinproteinsynthese. Die Ergebnisse auf translationaler Ebene konnten durch Promotorstudien auch auf transkriptioneller Ebene bestätigt werden. Die Induktion der HO-1 durch PGE1 war ebenfalls auf der Ebene der katalytischen Aktivität messbar. PGE1 zeigte weiterhin antioxidative Effekte in einem Zellkulturmodell für oxidativen Stress.
Nachdem eine Induktion der HO-1 auf unterschiedlichen Ebenen und in verschiedenen Zellsystemen gezeigt werden konnte, sollte am Beispiel des PGE1 der mögliche Mechanismus der Genaktivierung näher untersucht werden. Da das cyclische Nukleotid cAMP ein wichtiger Botenstoff für Prostaglandin-vermittelte Wirkungen ist, wurden zunächst intrazelluläre cAMP-Spiegel nach Prostaglandinstimulation bestimmt. Für PGE1 und Iloprost konnte eine konzentrationsabhängige Erhöhung der intrazellulären cAMP-Spiegel gezeigt werden. Im Gegensatz dazu erhöhten d-PGJ2 und PGF in den eingesetzten Konzentrationen die cAMP-Konzentrationen nicht. Ein kausaler Zusammenhang zwischen dem Botenstoff cAMP und der Induktion der HO-1 durch PGE1 konnte in abschließenden Untersuchungen dargestellt werden. Unter Verwendung von spezifischen Inhibitoren der Adenylatcyclase (DDA) und der Proteinkinase A (KT5723) konnte die PGE1-vermittelte HO-1-Induktion nahezu vollständig aufgehoben werden. Mit Hilfe von Deletionsmutanten konnte im Genreporterassay schließlich die Beteiligung eines cAMP response elements (CRE) bei der PGE1-induzierten Aktivierung des HO-1-Promotors festgestellt werden.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass das Prostaglandinderivat PGE1 ein potenter Aktivator des HO-1/Ferritin-Systems ist. Die Induktion der HO-1 über eine cAMP-abhängige Kaskade durch PGE1 ist ein hier erstmalig beschriebener Signalweg. Die zellprotektiven und antioxidativen Eigenschaften der HO-1 könnten einen zusätzlichen therapeutischen Nutzen bei der Therapie der arteriellen Verschlusskrankheit, aber auch bei anderen inflammatorischen Prozessen bedeuten.

The present study investigates the involvement of heme oxygenase-1 (HO-1) and ferritin in mediating cytoprotective and antioxidant actions of prostaglandins. The prostaglandin derivates PGE1, iloprost and d-PGJ2, in contrast to PGF, led to an increased expression of HO-1 protein in endothelial cells and macrophages in a concentration and time-dependent manner. Furthermore, PGE1 caused an increase in ferritin protein expression. These findings could also be verified at the transcriptional level through gene reporter assays. PGE1-induced HO-1 protein expression was accompanied by an increased catalytic activity of the enzyme. PGE1 also reduced NADPH-dependent production of reactive oxygen species at concentrations which were effective in HO-1 induction.
In subsequent experiments the underlying mechanisms of PGE1-mediated HO-1 induction were investigated. As adenosine 3-5-cyclic monophosphate (cAMP) is an important intracellular signaling molecule in mediating prostaglandin effects, we examined intracellular levels of cAMP. PGE1 and iloprost increased intracellular cAMP levels in a concentration-dependent manner. In contrast, d-PGJ2 and PGF did not alter cAMP concentration. To determine whether PGE1-dependent induction of HO-1 was regulated via the cAMP pathway, cell cultures were preincubated with different selective inhibitors. Inhibition of adenylate cyclase or protein kinase A using DDA and KT5720 efficiently inhibited PGE1-induced HO-1 expression. By using luciferase promotor constructs and mutational analysis, it was demonstrated that a cAMP-responsive element (CRE) is responsible for the induction of HO-1 transcription by PGE1.
These findings show that PGE1 is a novel, potent activator of the HO-1/ferritin system through a cAMP-dependent cascade. Activation of the HO-1 gene via PGE1 may clinically translate into an antioxidant protection of vascular and non-vascular tissue and thus prevent atherogenesis as well as other inflammatory or autoimmune processes.

Keywords:
Prostaglandine, Atherosklerose, antioxidativer Schutzmechanismus, Hämoxygenase-1, Ferritin, cAMP, Adenylatzyklase, Proteinkinase A, Endothelzellen, Makrophagen

prostaglandins, atherosclerosis, antioxidant defense mechanism, heme oxygenase-1, ferritin, cyclic AMP, adenylate cyclase, protein kinase A, endothelial cells, macrophages

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis (4, 1-6)
1 Einleitung (7-26)
2 Problemstellung (27-28)
3 Material und Methoden (29-46)
4 Ergebnisse (47-84)
5 Diskussion (85-94)
6 Zusammenfassung (95-96)
7 Literaturverzeichnis (97-117)
8 Veröffentlichungen (118)