Franziska Leich

Design zytotoxischer RNase A-Tandemenzyme als potentielle Antitumortherapeutika

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 20.02.2009

Abstract
Da die biologische Funktion von Ribonukleasen (RNasen) hauptsächlich im Abbau zellulärer RNA besteht, können sie als Toxine mit vielversprechendem therapeutischen Antitumorpotential betrachtet werden. Ein allgemeines Modell der zytotoxischen Wirkung von RNasen, das die Interaktion der RNasen mit der Zellmembran der Zielzelle, ihre Internalisierung und Translokation ins Zytosol und den dortigen Abbau der RNA umfasst, wird generell akzeptiert. Die mit der enzymatischen RNA-Spaltung verbundene Induktion apoptotischer Prozesse führt letztendlich zum Zelltod. Das Zusammenspiel dieser Vorgänge sowie der Einfluss der thermodynamischen und proteolytischen Stabilität der RNasen, der katalytischen Aktivität und der Affinität zum intrazellulär vorhandenden RNase-Inhibitor (RI) auf die Zytotoxizität konnte jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt werden. In vitro wird die zytotoxische Wirkung der meisten RNasen durch den RI drastisch herabgesetzt, so dass die Entwicklung RIevasiver RNasen ein anzustrebendes Ziel darstellt.
Ziel dieser Arbeit war es, durch Tandemisierung pseudo-dimere, zytotoxische, auf RNase A basierende Konstrukte zu generieren. Dazu wurden auf gentechnischem Weg durch Genduplikation zwei RNase A-Moleküle mittels eines Peptidlinkers fusioniert. Die sogenannten RNase A-Tandemenzyme sollten aus sterischen Gründen eine verminderte Affinität zum RI aufweisen, so dass ihre enzymatische Aktivität intrazellulär aufrechterhalten wird. Im Gegensatz zur nicht zytotoxischen RNase A vermitteln die RNase A-Tandemenzyme eine deutliche Toxizität gegenüber Tumorzellen (K562). Durch den Zytotoxizitätstest wurden IC50-Werte in einem Bereich von 70,3-12,9 µM ermittelt, obwohl die in vitro Untersuchungen zur Inhibierung der Tandemkonstrukte durch den RI überraschenderweise ein RNase A-ähnliches Inaktivierungsverhalten ergaben.

Due to their ability to degrade RNA, selected members of the bovine pancreatic ribonuclease A (RNase A) superfamily are potent cytotoxins. The cytotoxic action requires the interaction of the enzyme with the cellular membrane, its internalization and translocation to the cytosol, and the degradation of ribonucleic acid whereby they cause cell death. The interplay of these processes as well as the role of the thermodynamic and proteolytic stability, the catalytic activity, and the evasion from the intracellular ribonuclease inhibitor (RI) has not yet been fully elucidated. In vitro, the catalytic activity of most RNases, however, is abolished by RI, which might derogate their applicability as cytotoxins. Consequently, the development of RNase derivatives with the ability to evade RI binding is a desirable goal. In this work, tandem enzymes consisting of two RNase A units that are covalently bound via a peptide linker were generated by gene duplication. As deduced from the alignment of the crystal structure of the tandem enzymes with that of the RI•RNase A complex, one RNase A unit of the tandem enzyme can still be bound by RI. The other unit, however, should remain unbound because of steric hindrance. This free RNase A unit was expected to maintain its activity and to act as a cytotoxic agent. Despite a complete in vitro inhibition by RI, tandemization was found to endow RNase A with remarkable cytotoxic activity. While monomeric RNase A is not cytotoxic, IC50 values of the RNase A tandem variants of 70.3-12.9 µM were determined. Hence, the RI sensitivity of the tandem enzymes was apparently surmounted by an enhanced endocytosis efficiency.

Keywords:
Ribonuklease A, Zytotoxizität, Ezymstabilität, Tandemenzym, Proteinengineering, Internalisierung

ribonuclease A, cytotoxicity, enzyme stability, protein engineering, tandem enzyme, internalization

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Inhaltsverzeichnis
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Symbole und Abkürzungen
1 Einleitung und Aufgabenstellung (1-2)
2 Theoretischer Teil (3-28)
3 Materialien und Methoden (29-58)
4 Ergebnisse und Diskussion (59-96)
5 Zusammenfassung und Ausblick (97-99)
6 Literaturverzeichnis (100-114)
7 Abbildungsverzeichnis (115-116)
8 Tabellenverzeichnis (117)
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