Hasson Mana

Automatische Flow Injection Analysis-Verfahren für die Lebensmittel-, Umwelt- und klinische Analytik

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 18.11.1998

Abstract
In der Dissertationsschrift sind neue fluorimetrische und vollautomatisierte Fließinjektionsanalyse(FIA)-Verfahren beschrieben worden. Diese beruhen auf der Derivatisierungsreaktion von Ammonium und reduzierenden Schwefelverbindungen mit o-Phthalaldehyd (OPA) und auf der fluorimetrischen Detektion der entstehenden Isoindolderivate.
Ein selektives, schnell reagierendes und total wäßriges OPA-Reagenz wurde für die empfindliche Detektion von Ammoniak/Ammonium entwickelt. Das Detektionslimit (DL) beträgt 20 nM. Diese Detektionsmethode wurde zur Bestimmung von Analyten ausgenutzt, die enzymkatalytisch unter Ammoniakfreisetzung umgesetzt werden. Auf diese Weise wurden FIA-Verfahren zur Bestimmung von Harnstoff, Creatin, Creatinin, Glutamat, Glutamin und Lysin (DL 0.1-1.0 ÁM) entwickelt.
Eine Multikanal-FIA-Anordnung wurde für die sequentielle Bestimmung von Ammoniak, Creatin, Creatinin und Harnstoff oder von Glutamat, Glutamin und Ammoniak konstruiert. Die präzise Detektion von Enzymaktivitäten, die Ammoniak freisetzen wie z.B. von Urease wurde realisiert. Dies öffnet einen Weg zur Bestimmung von Ureaseinhibitoren wie z.B. Cu(II)- und Ag(I)-Ionen.
Die in situ Herstellung eines inversen OPA-Reagenzes bei der Mischung von OPA- und Ammoniumlösung ermöglicht ein hochsensitives FIA-Verfahren zur Bestimmung von Sulfit (DL 50 nM), Sulfid (DL 800 nM) und Thiolen. Die fluorimetrische Detektion von Thiocholin (DL 80 nM) kann für das automatische Assay zur Bestimmung von Acetylcholinesteraseinhibitoren angewendet werden. Acetylcholin-esterase wurde an magnetische Mikropartikel immobilisiert. Eine FIA-Anordnung mit einer Inkubationszelle, die in einen Elektromagneten eingebaut ist, wurde für die sensitive Detektion von Carbofuran und Paraoxon (DL 13.5 und 17.5 nM) konstruiert und angewendet.
Das inverse OPA-Reagenz konnte auch für die Bestimmung anderer polarer Thiole wie z.B. von reduziertem Glutathion (DL 60 nM) und Cystein (DL 5 ÁM) angewendet werden. Ein selektives Verfahren wurde für die Detektion von reduziertem Glutathion in der Anwesenheit von Dithiotreitol, Cystein, oxidiertem Glutathion, Cystin und Methionin entwickelt. Oxidiertes Glutathion wurde nach seiner Reduktion mit Dithiotreitol bestimmt.
Vollautomatisierte FIA-Immunoassays (FIIA) wurden auf der Basis von an magnetische Mikropartikel immobilisierten Antikörpern und Magnetseparation entwickelt. Atrazin, Metolachlor, Carbofuran und 2,4-Dichlorphenoxyacetat wurden im mgl-1-Bereich (0.1) bestimmt.
Durch die Kombination des FIIA-Verfahrens mit der Festphasenextraktion (SPE) konnte das Detektionslimit von 2,4-Dichlorphenoxyacetat um das 50-fache verbessert werden. SPE kann auch mit der FIA-Anordnung zur Bestimmung von Acetylcholinesteraseinhibitoren (Carbofuran und Paraoxon) mit dem Ziel kombiniert werden, das Detektionslimit um den Faktor 50 zu kleineren Konzentrationen (DL 270 und 350 fM) zu verschieben.

In the doctoral thesis new fluorimetric and fully automated flow injection analysis (FIA) procedures were described. These FIA procedures are based on the derivatization reaction of ammonia and reducing sulphur compounds with o-phthalaldehyde (OPA) and the fluorimetric detection of the generated isoindol derivates.
A selective, fast reacting and totally aqueous OPA reagent was developed for the sensitive determination of ammonia/ammonium. The detection limit (DL) was 20 nM. This detection is combined with enzyme catalyzed conversion of ammonia releasing analytes. On this basis FIA procedures were developed for the determination of urea, creatin, creatinin, glutamate, glutamine, and lysine (DL 0.1-1.0 ÁM). A multichannel FIA set-up was constructed for the sequential determination of ammonia, creatin, creatinin and urea or of glutamate, glutamine and ammonia. The precise determination of ammonia releasing enzyme activities, e.g. of urease was implemented. This opened up a way to determine inhibitors of urease, e.g. Cu(II) and Ag(I) ions.
By the in situ preparation of inverse OPA reagents by premixing of OPA and ammonium solutions highly sensitive detection procedures were implemented for the FIA determination of sulphite (DL 50 nM), sulphide (DL 800 nM) and thiols. The fluorimetric detection of thiocholine (DL 80 nM) can be applied for an automatic assay for acetylcholinesterase inhibitors. Acetylcholinesterase was immobilized on magentic microbeads. A FIA set-up with a magnetic separation and incubation cell was constructed and applied for the sensitive determination of carbofuran and paraoxon(DL 13.5 and 17.5 nM).
The inverse OPA reagents could also be used for the determination of other polar thiols, e.g. reduced glutathione (DL 60 nM) and cysteine (DL 5 ÁM). A selective procedures was developed for the determination of reduced glutathione in the presence of dithiotreitol, cysteine, oxidized glutathione, cystine and methionine. Oxidized glutathione was determined after its reduction by dithiotreitol.
Fully automated FIA immunoassays (FIIA) were developed on the basis of antibodies immobilized on magnetic microbeads and the magnetic separation. Atrazine, metolachlor, carbofuran and 2,4-dichlorphenoxyacetic acid were determined in the lower mgl-1 range (0.1).
By the combination of the FIIA procedure with a solid phase extraction system (SPE) the detection limit of 2,4-dichlorphenoxyacetic acid could be improved 50-fold. SPE can be combined also with the FIA set-up for determination of acetylcholinesterase inhibitors (carbofuran and paraoxon) with the aim to shift the detection limit to lower concentrations about the factor 50 (DL 270 and 350 fM).

Keywords:
Flow injection analysis (FIA), ortho-phthalaldehyde (OPA), Ammonia, Urea, Creatinin, reducing sulphur compounds, Thiocholine, Acetylcholinesterase, Pestisides, Flow injection immunoassay (FIIA)

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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis, Verzeichnis der verwendeten Symbole (1-8)
1. Einleitung (1-2)
2. Theoretischer Teil (3-26)
3. Experimenteller Teil (27-43)
4. Ergebnisse und Diskussion (44-116)
5. Zusammenfassung (117-118)
Literaturverzeichnis (119-128)
Anhang (129-138)