Axel Schmidt

Hydroxyzimtsäureamide in Zellkulturen von Kartoffel: Isolierung und Charakterisierung eines THT cDNA-Klons aus Solanum tuberosum

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
verteidigt am 24.11.1999

Abstract
Eine der am häufigsten vorkommenden Krankheiten der Kartoffelpflanze (Solanum tuberosum L.) ist die Blatt- und Knollenfäule, die durch Befall mit dem Pilz Phytophthora infestans ausgelöst wird.
Pflanzen haben zum Schutz vor Pathogenen effiziente Abwehrmechanismen entwickelt. Die pflanzliche Zellwand stellt dabei die erste wirkungsvolle Barriere gegenüber einem potentiellem Pathogen dar. Eingelagerte phenolische Verbindungen könnten nach Pathogenbefall zu einem fungistatischen Zellwandkomplex und weiterführend zu einer erhöhten Resistenz der Pflanze führen. Unter anderem könnten dabei in Hydroxyzimtsäureamide, wie z.B. 4-Cumaryl- und Feruloyltyramin sowie 4-Cumaroyl- und Feruloyloctopamin, deren Bildung durch das Enzym der Hydroxzimtsäure-CoA: Tyramin N-Hydroxyzimtsäuretransferase (THT) katalysiert wird, eine Bedeutung besitzen. Die Existenz dieser Verbindungen sowie der THT konnte bisher vorallem in Kartoffel (Solanum tuberosum L.) und Tabak (Nicotiana tabacum) nachgewiesen werden (Negrel & Javelle, 1997; Schmidt et al., 1998).
Eine aus elicitierten Zellkulturen von Kartoffel (Solanum tuberosum L. cv. Desirée) hergestellte cDNA Bank sowie eine genomische Bank wurden mit einem THT-spezifischem PCR-Fragment gescreent. Der THT-codierende Bereich wurde kloniert und in E.coli exprimiert. Die rekombinante THT besteht aus 248 Aminosäuren, besitzt eine berechnete Molmasse von 28,4 kDa und zeigt eine dimere Struktur. Die Sequenz ist nahezu homolog zur THT aus Tomate (Farmer et al., 1999) und zeigt teilweise Übereinstimmung zu Spermidin/Spermin N-Acetyltransferasen (Lu et al., 1996). Die biochemischen Eigenschaften stimmen weitgehend mit dem aus Kartoffel-Zellkulturen gereinigten Protein überein. Transkriptmengen wurden hauptsächlich in Wurzeln der Kartoffelpflanze lokalisiert. Die THT ist als Multigen kodiert (Schmidt et al., 1999). Eine Akkumulation von Transkripten konnte nach Verwundung, Behandlung mit P. infestans-Sporensuspension, Bakterieninokulation sowie nach Abscisinsäure-, Salicylsäure- und Methyljasmonat-Behandlung von Kartoffelblättern nachgeweisen werden. Transgene Kartoffel- und Tabakpflanzen zeigten bisher keine erhöhte THT-Aktivität.
Da es bisher nicht möglich war THT-sensitive Antikörper zu gewinnen, soll zukünftig eine erneute Herstellung erfolgen. Neue transgene Pflanzen, die eine im Vergleich zum Wildtyp erhöhte THT-Aktivität besitzen, sollen hergestellt und auf eine erhöhte Resistenz gegenüber P. infestans hin untersucht werden. Vorhandene genomische THT-Klone sollen genutzt werden, um Promotorstudien durchzuführen. Letztendlich soll die THT kristallisiert und die Raumstruktur aufgeklärt werden.

As part of the plantīs response to pathogen attack, cell wall bound phenolics such as amides of hydroxycinnamic acids and tyramine accumulate, presumably functioning in reinforcement of the cell wall and as antifungal compounds. In potato, treatment of suspension-cultured cells with a crude elicitor preparation of phytophthora infestans leads to an increase in the activity of hydroxycinnamoyl-CoA:tyramine N-(hydroxycinnamoyl)-transferase (THT), the enzyme catalyzing the last step in the synthesis of hydroxycinnamoyltyramines.
Using degenerate primers derived from amino-acid sequences of THT pepetides, a THT-specific fragment was obtained by RT-PCR. A cDNA libraray constructed from RNA of elicited potato cells was screened with the PCR-fragment as a probe and several THT-specific cDNAs were isolated. One clone covering the complete coding region was used for expression of THT in E.coli. Extracts of bacteria containing this clone showed high THT enzyme activity with coumaroyl-CoA and tyramines as substrates. The recombinant proteins showed a molecular weight of 28.4 kDa. Gel filtration revealed that the active enzyme was a dimer (Schmidt et al., 1999). Sequenze analyses showed homology to the THT from tomato (Farmer et al., 1999) and to the consensus sequenze of spermidin/spermin N-Acetyltransferases (Lu et al., 1996). Accumulation of THT-transcripts in elicitor treated potato suspensioned cells corellated with the increase in enzyme activity. Enzyme activity and biochemical properties are comparable to that of purified enzyme from potato suspensioned cells. Genomic Southern analyses indicated that in potato plants THT is encoded by a multigene family. Analyses of tissue-specific distribution of THT mRNA in intact plants revealed highest levels in roots. Additional THT transcripts accumulation were found after wounding, treatment with suspension of P. infestans-spores, after bacterial inoculation and after treatment with abscisic acid, salicylic acid and methyljasmonate. Transgenic plants showed actually no THT-activity.
In the future we hope to investigate the increased resistance of new transgenic potato plants against the infection with P.infestans and the THT-detection with antibodies. Genomic clones we will use for promotor studies. In cooperation with the GBF in Braunschweig we will crystallize the enzyme.

Literatur: / literature:
  • Lu, L., Berkey, K. A. und Casero, R. A., Jr. (1996) RGFGIGS Is an Amino Acid Sequence Required for Acetyl Coenzyme A Binding and Activity of Human Spermidine/Spermine N1 Acetyltransferase, J. Biol. Chem. 271, 18920-18924
  • Negrel, J. und Javelle, F. (1997) Purification, characterization and partial amino acid sequencing of hydroxycinnamoyl-CoA:tyramine N-(hydroxycinnamoyl)transferase from tobacco cell-suspension cultures, Eur. J. Biochem. 247, 1127-1135
  • Farmer, M. J., Czernic, P., Michael, A., Negrel, J. (1999) Identification and characterization of cDNA clones encoding hydroxycinnamoyl-CoA:tyramine N-hydroxycinnamoyl-transferase from tobacco, Eur. J. Biochem 263, 686-94
  • Schmidt, A., Grimm, R., Schmidt, J., Scheel, D., Strack, D. und S. Rosahl (1999) Cloning and Expression of a Potato cDNA Encoding Hydroxycinnamoyl-CoA:Tyramine N-(Hydroxycinnamoyl)transferase, J. Biol. Chem. 274, 4273-4280
  • Schmidt, A., Scheel, D. und Strack, D. (1998) Elicitor-stimulated biosynthesis of hydroxycinnamoyltyramines in cell suspension cultures of Solanum tuberosum, Planta 205, 51-55
  • Keywords:
    THT, Tyramin Hydroxyzimtsäuretransferase, Hydroxyzimtsäureamide, Coumaroyltyramin, Elicitierung, Kraut- und Knollenfäule, Phytophthora infestans, Kartoffel, Solanum tuberosum

    THT, Tyramin Hydroxycinnamoyltransferase, Hydroxycinnamic acid amides, Coumaroyltyramine, Elicitation, Late blight, Phytophthora infestans, Potato, Solanum tuberosum

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    Inhaltsverzeichnis
    Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis
    1 Einleitung (1-12)
    2 Material und Methoden (13-34)
    3 Ergebnisse (35-62)
    4 Diskussion (63-76)
    5 Zusammenfassung (77)
    6 Literatur (78-88)